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在细胞培养领域，永生化人骨髓间充质细胞 – hTERT 始终是前沿研究的热点。它凭借工作原理，为细胞生物学研究、药物开发和再生医学探索开辟了全新路径。本文将深入剖析其工作原理，助力科研人员更好地利用这一强大工具。

一、hTERT 的关键作用

hTERT 即人端粒酶逆转录酶，是端粒酶复合体的核心功能亚基。在正常体细胞中，端粒酶活性较低，随着细胞分裂次数增多，端粒逐渐缩短，最终细胞进入衰老状态。而通过将 hTERT 基因导入人骨髓间充质细胞，可重新激活端粒酶活性，使细胞具备永生化特性。

端粒酶激活后，能够以自身的 RNA 成分为模板，合成端粒重复序列并添加到染色体末端，维持染色体完整性。这相当于为细胞的分裂能力装上了“永动机"，突破了细胞的自然增殖极限，为大规模细胞培养和长期实验研究提供了稳定细胞来源。

二、细胞生理特性转变

（一）细胞周期调控改变

在 hTERT 永生化过程中，细胞周期调控机制发生显著变化。细胞周期由 G1、S、G2 和 M 期组成，其中 G1 期是细胞生长和准备 DNA 合成的关键阶段。hTERT 的引入使细胞在 G1 期的停滞时间缩短，加速进入 S 期进行 DNA 合成，从而提高细胞增殖速率。

具体而言，hTERT 激活后，细胞内 cyclin D1 等细胞周期蛋白表达上调。这些细胞周期蛋白与 cyclin 依赖性激酶（CDK）结合，形成活性复合物，磷酸化 Rb 蛋白等下游底物，解除对细胞周期的抑制，促使细胞快速通过限制点，进入 S 期，实现细胞周期的加速运转。

（二）细胞代谢重塑

细胞代谢是维持细胞生命活动的核心过程，永生化后细胞的代谢模式发生重塑以适应持续增殖的需求。细胞的糖代谢途径发生改变，糖酵解过程增强，即使在氧气充足的情况下，细胞也倾向于通过糖酵解产生 ATP，而非全依赖线粒体的氧化磷酸化。这种代谢模式被称为“瓦博格效应"。

此外，细胞的氨基酸代谢和脂肪酸合成也显著增强。氨基酸代谢为细胞提供合成生物大分子所需的氮源和碳源，脂肪酸合成则为细胞膜的生物合成提供原料，满足细胞快速增殖过程中细胞膜扩增的需求。代谢产物如 α - 酮戊二酸等还参与细胞内的信号转导，调节细胞增殖、分化和凋亡等生理过程，形成复杂的代谢与信号调控网络，共同支持细胞的永生化状态维持。

（叁）细胞基因表达重编程

基因表达调控是细胞生理功能实现的基础，hTERT 永生化引发细胞基因表达重编程。一系列与细胞增殖、抗凋亡和代谢相关的基因表达上调，而与细胞衰老和分化相关的基因表达下调。

例如，细胞增殖相关基因如 MYC、cyclin E 等表达增加，MYC 蛋白能够结合到基因启动子区域，激活一系列促进细胞周期进展和蛋白质合成的基因表达，推动细胞增殖；抗凋亡基因如 BCL - 2、BCL - XL 等表达升高，这些基因编码的蛋白能够抑制细胞凋亡信号通路中线粒体释放细胞色素 C 等关键步骤，阻止细胞凋亡的发生，使细胞能够在较长时间内保持活力。同时，细胞衰老相关基因如 p16、p21 等表达受到抑制，减少对细胞周期的负向调控，进一步保障细胞的持续增殖能力。基因表达重编程为细胞在永生化后的长期存活和功能维持提供分子基础。

叁、细胞功能特性维持与拓展

（一）干细胞特性的保留与强化

尽管细胞实现了永生化，但其干细胞特性不仅得以保留，还得到一定程度的强化。细胞仍具有自我更新能力，在适宜的培养条件下能够持续产生与亲代细胞具有相同特征的子代细胞，保持细胞群体的均一性和稳定性。同时，细胞的多向分化潜能也得以维持，能够在特定诱导因素的作用下分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多种细胞类型。

例如，在含有地塞米松、β - 甘油磷酸钠和抗坏血酸等成骨诱导因子的培养基中培养，细胞能够启动成骨相关基因如 RUNX2、OSTEOPONTIN 等的表达，合成并分泌骨基质蛋白，形成钙化结节，完成向成骨细胞的分化转变，展现出在骨组织工程领域的应用潜力。这种干细胞特性的保留与强化，使细胞在再生医学研究中具有重要价值，为组织修复和再生提供细胞来源。

（二）细胞间通讯能力的增强

细胞间通讯对于细胞群体的协调生长和功能发挥至关重要，永生化后细胞的细胞间通讯能力得到增强。细胞通过旁分泌和自分泌等多种方式分泌多种细胞因子和生长因子，如 VEGF（血管内皮生长因子）、PDGF（血小板衍生生长因子）、IL - 6（白细胞介素 - 6）等。

这些因子在细胞间传递信号，调节细胞的增殖、迁移和分化等生理活动。以 VEGF 为例，它能够与邻近细胞表面的 VEGF 受体结合，激活下游信号通路，促进血管生成，改善细胞微环境中的血液供应，为细胞的生长和组织修复提供营养支持。同时，细胞分泌的生长因子还能反馈调节自身和其他细胞的增殖状态，形成复杂的细胞间通讯网络，增强细胞群体的整体功能和适应性。

四、细胞培养条件优化

（一）培养基成分精准调控

培养基是细胞生长的“土壤"，其成分的精准调控对永生化人骨髓间充质细胞 – hTERT 的培养至关重要。基础培养基通常选用含有丰富营养成分的 α - MEM 或 DMEM 培养基，这些培养基含有氨基酸、维生素、葡萄糖等基本营养物质，满足细胞的代谢需求。

在此基础上，添加适量的胎牛血清是必要的，血清中含有多种生长因子、细胞黏附因子和营养成分，如胰岛素、转铁蛋白等，能够促进细胞的贴壁和增殖。但血清成分复杂，为避免血清中潜在的未知成分对实验结果产生干扰，还可以采用无血清培养基，并添加特定的生长因子组合，如 FGF - 2（成纤维细胞生长因子 - 2）、EGF（表皮生长因子）等，精确调控细胞的生长和分化状态。同时，为维持细胞的的最佳生长环境，还需要精确控制培养基中的无机盐浓度和 pH 值，一般将 pH 值维持在 7.2 - 7.4 之间，通过添加碳酸氢钠等缓冲剂来实现稳定 pH 值的目的。

（二）培养环境精细设置

适宜的物理环境是细胞良好生长的保障。温度是关键因素之一，一般将细胞培养环境温度设置为 37℃，这是因为人体正常生理温度接近 37℃，细胞在这一温度下能够保持最佳的酶活性和代谢速率，有利于细胞的正常生长和增殖。湿度也需维持在较高水平，通常保持培养箱内湿度在 95% 以上，防止培养基中水分过度蒸发，导致培养基成分浓度改变，影响细胞生长环境的稳定性。

气体环境方面，细胞需要 5% 二氧化碳和 95% 空气的混合气体环境。二氧化碳在培养环境中起到调节 pH 值的作用，它能够与培养基中的碳酸氢钠反应生成碳酸，从而维持培养基 pH 值的稳定。为确保细胞在培养过程中始终处于适宜的气体环境中，培养箱需配备精确的气体控制系统，实时监测和调节气体成分比例。

（叁）细胞传代策略制定

合理的细胞传代策略能够确保细胞的长期稳定培养和功能维持。当细胞生长至一定密度，一般达到 80% - 90% 汇合度时，即可进行传代操作。传代过程需采用温和的胰酶消化方法，消化时间控制在 1 - 2 分钟，避免过度消化导致细胞膜受损或细胞内酶活性丧失，影响细胞的再贴壁和后续生长。

细胞传代比例根据细胞生长特性和实验需求确定，通常采用 1 : 3 或 1 : 4 的传代比例。较低的传代比例有助于细胞较快地适应新环境并进入生长期，但可能导致培养容器空间较快耗尽；较高的传代比例则可延长细胞的培养周期，但初期细胞密度较低，可能需要较长时间才能达到理想生长状态。因此，在实际操作中，需要根据细胞的具体生长情况和实验安排灵活调整传代比例，以实现细胞培养的高效性和稳定性。