在笔滨双染细胞凋亡检测中，细胞悬液的制备是决定实验成败的关键步骤之一。PI(碘化丙啶)常与Annexin V联合使用，构成经典的Annexin V-FITC/PI双染法，用于区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。该方法依赖于细胞膜完整性和磷脂酰丝氨酸外翻等生物学特征，因此对细胞悬液的质量要求高。以下是细胞悬液制备过程中的几项关键技巧。
首先，细胞收集需温和操作。无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，在收获过程中应避免剧烈吹打或高速离心，以防人为造成细胞膜损伤，导致假阳性结果。贴壁细胞建议使用不含贰顿罢础的胰酶进行消化，并在显微镜下确认细胞全部脱离但形态完整后再终止消化。消化时间过长或机械刮取都可能破坏细胞膜，使笔滨非特异性渗入，干扰凋亡判断。
其次，洗涤步骤必须规范。收集后的细胞需用预冷的PBS轻柔洗涤1–2次，以去除培养基中的血清和其他杂质。血清中含有可结合Annexin V的成分，若未洗净会影响染色效果。同时，所有操作应在4℃或冰上进行，以减缓细胞代谢，防止在处理过程中发生自发性凋亡或坏死。
第三，细胞浓度和状态至关重要。理想的细胞悬液浓度应控制在1×10?cells/mL左右，过高会导致染色不均，过低则影响流式检测信号强度。此外，细胞活力应在90%以上，可通过台盼蓝染色初步评估。若起始样本中已有大量死亡细胞，将严重影响笔滨双染细胞凋亡结果的准确性。
而且，重悬缓冲液的选择很关键。Annexin V结合需要钙离子参与，因此应使用含Ca²?的Binding Buffer重悬细胞，而非纯PBS或去离子水。正确的缓冲体系不仅能维持细胞生理状态，还能确保Annexin V有效识别外翻的磷脂酰丝氨酸。
综上所述，在笔滨双染细胞凋亡检测中，细胞悬液的制备需兼顾温和操作、规范洗涤、适宜浓度及正确缓冲体系。只有严格把控这些细节，才能获得可靠、可重复的凋亡检测数据，为后续机制研究或药物筛选提供坚实基础。
更新时间：2025-11-18
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