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基因组修饰架构

hTERT 插入位点位于大鼠 4 号染色体 q42 区域，采用 PiggyBac 转座系统实现单拷贝整合。载体骨架携带 puromycin-IRES-eGFP 双报告元件，读码框与 hTERT 共用同一启动子 CMV-early。Southern blot 使用 5′-hTERT 探针可检出 4.7 kb 单一条带，确认无随机多拷贝插入。插入后基因组完整性经全基因组测序验证，SNV 负荷 < 2.5/Mb。

倍增动力学曲线

培养基条件下，细胞倍增时间为 23.2 ± 1.4 h（P10–P30）。绘制 0–60 代累积群体倍增（CPD）曲线可见线性区间延长至 58 CPD，斜率 0.96，表明 hTERT 持续抵消复制性衰老。进入 60 CPD 后斜率降至 0.38，提示后期需重新单克隆化以维持群体同质性。

血脑屏障表型指标

• 紧密连接蛋白：ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达量与原代 BMEC 差异 < 5%，Western blot 条带无降解拖尾。

• 跨内皮电阻：24 孔板 0.4 µm 插入式培养 72 h 后 TEER 峰值 287 ± 12 Ω·cm?，LPS 刺激 6 h 降至 54 Ω·cm?，撤药 24 h 恢复至 215 Ω·cm?，显示可逆屏障功能。

• 外排转运体活性：Rh123 外排率 78%，Calcein-AM 实验验证 P-gp、BCRP 功能 IC?? 分别为 3.2 µM 与 1.9 µM。

冷冻保存与复苏窗口

冻存液配方：90 % FBS + 10 % DMSO，细胞密度 4 × 10? cells/mL。程序降温仪梯度：-1 °C/min 至 -80 °C，次日入液氮。复苏后 4 h 贴壁率 92 %，24 h 存活率 97 %。超过 5 年的液氮储存样本复苏，存活率仍 > 85 %，hTERT 表达无衰减。

支原体与微生物检测阈值

每批次放行标准：

• qPCR 支原体检测 Ct ≥ 35（阴性）

• 细菌、真菌 14 天培养无生长

• 内毒素 < 0.1 EU/mL

报告随货附带原始电泳图与荧光曲线，可溯源至第叁方检测实验室编号。

染色体核型稳定性

G-banding 核型分析显示 42,XY 模式保持率 98 %，结构异常率 2 % 以内，主要异常集中在 11 号染色体短臂重复，不影响血脑屏障功能相关基因座。每 10 代核型复查一次，报告公开下载。

荧光标记兼容性

内置 eGFP 信号强度 6 × 10? RFU/cell，适合共聚焦成像及流式检测。若需二次标记，推荐 mCherry 或 iRFP720，避免与 eGFP 光谱重叠。转染效率 Lipofectamine 3000 条件下 72 h 达 85 %，CRISPR-Cas9 RNP 电穿孔效率 61 %，HDR 模板插入率 22 %。

批次间差异控制

采用 Master Cell Bank 两级库制度：MCB（P5）与 WCB（P15）。每个 WCB 只卖 200 支，用完即废，确保实验周期内基因表达漂移 < 3 %。每批次附带 qPCR 阵列数据，监测 90 个血脑屏障关键基因表达，热图差异 > 1.5 倍立即停售。